Project R-3580

Ontwikkeling van een generische in vivo -systeem voor plaatsspecifieke modificatie van proteïnen met 'click'- gefunctionaliseerde aminozuren voor de design van innovatieve bio-actieve materialen (Onderzoek)

Het covalent en georiënteerd immobiliseren van proteïnen op vaste dragers is van groot belang voor de ontwikkeling en verbetering van vele hedendaagse technologieën. Een goed voorbeeld hiervan is een biosensor. Een biosensor bestaat ruwweg uit drie delen: een biologische receptor, een signaaloverbrengend platform (transducer) en een dataverwerkingssysteem. Deze biologische receptoren zijn in staat zeer specifieke doelmoleculen, vaak aanwezig in zeer lage concentraties in de te analyseren omgeving, te herkennen en aan zich te binden. Wanneer deze binding plaatsvindt, resulteert dit in een fysico-chemische verandering in het systeem, die vervolgens omgezet wordt in een meetbaar signaal. Voor een optimale en gevoelige detectie is het nodig dat de biomoleculen georiënteerd zijn met hun actieve sites gericht naar het doelmolecule. Ook is het belangrijk dat er een stabiele binding is tussen de biomoleculen en het substraatoppervlak. Tot op heden worden proteïnen meestal random georiënteerd op het oppervlak zodat een deel gericht is met zijn actieve site naar het oppervlak, wat leidt tot een verminderde biologische activiteit van het gehele systeem. De tot nu toe gebruikte strategieën kunnen bovenstaande problemen niet oplossen. Om de problemen met oriëntatie en stabiliteit te omzeilen, zal er een in vivo methode ontwikkeld worden dat plaatsspecifiek bioorthogonale functionele groepen incorporeert in proteïnen. Aangezien er een sterk verband is tussen de conformatie en het functioneren van proteïnen en deze conformatie sterk beïnvloed wordt door factoren zoals pH en temperatuur, zijn de reactieomstandigheden voor het koppelen van het biomolecule aan het oppervlak zeer belangrijk. Een koppelingschemie dat onder milde omstandigheden kan doorgaan is nodig. Een veelbelovende oplossing voor dit kan samengevat worden onder de term "click" chemie. Deze reacties kunnen vlot opgaan in fysiologische omstandigheden en kamertemperatuur, wat hen zeer aantrekkelijk maakt voor het koppelen van proteïnen. Een zeer bekende "click" reactie is de Huisgen 1,3- dipolaire cycloadditie tussen alkynen en aziden. De introductie van "click" funcionele groepen in proteïnen zal gebeuren met behulp van de "ambersuppressie techniek". Hiervoor zal een genetisch gecodeerd, mutant, orthogonaal E.coli tyrosyl-tRNA synthetase (EcTyrRS)/tRNACUA paar ontwikkeld en gebruikt worden voor de expressie van "click" gemodificeerde proteïnen in S. cerevisiae. Een bibliotheek van mutante EcTyrRS zal geconstrueerd en gescreend worden voor de selectieve incorporatie van "click" gemodificeerde aminozuren. Het voordeel van deze strategie is dat het toelaat om proteïnen te produceren, die een genetisch gecodeerde bioorthogonale functionele groep (bv. Een alkyne of een azide) bevatten op één enkele strategisch gekozen locatie. In dit project zullen nanobodies (Nbs) gebruikt worden als proteïnesysteem. De incorporatie van een "click" gemodificeerd aminozuur op een genetisch gecodeerde positie geeft ons de controle om deze proteïnen met een welbepaalde oriëntatie covalent te koppelen. Dit maakt het mogelijk om oppervlakken te produceren die homogeen bedekt en optimaal bioactief zijn. Dit onderzoek zal gebeuren in de Biomolecule Design Group; waar al één PhD-student en één post-doc actief onderzoek doen naar de plaatsspecifieke modificatie van proteïnen en hun covalente koppeling van biomoleculen op vaste dragers.

01 januari 2012 - 31 december 2015